教育新闻网尽管科学家们仍不完全了解RNA分子的多样性，但据信与它们结合的蛋白称为RNA结合蛋白，与多种疾病形成有关。香港城市大学(CityU)生物医学科学家领导的研究导致了一种名为CARPID的新型检测方法，该方法可鉴定活细胞中特定RNA的结合蛋白。有望将该创新技术应用于各种类型的细胞研究，从鉴定癌症诊断的生物标志物到检测治疗病毒性疾病的潜在药物靶标。
这项研究由城大生物医学系(BMS)的严坚博士，张亮博士和陈奎明博士与西安西北大学的科学家共同领导。一个。他们的发现发表在科学杂志《自然方法》上，标题为“ CRISPR辅助检测活细胞中RNA-蛋白质相互作用”。
结合蛋白决定RNA功能
分子生物学的中心教条表明，DNA被转录为RNA，RNA被翻译为蛋白质。但实际上，只有大约2%的RNA编码蛋白质。其余98%的非编码RNA(ncRNA)因其神秘的功能而被视为“暗物质”。
近年来，科学家付出了很多努力来揭示RNA的实际功能，尤其是长的非编码RNA(lncRNA，即长度超过200个核苷酸的ncRNA)。LncRNA已被广泛接受为参与基因表达调控的重要细胞成分。严博士说：“ LncRNA是最有趣的RNA种类。”这也是该团队选择lncRNA作为研究对象的原因。
尽管lncRNA不产生蛋白质，但它们将与蛋白质反应，相互作用将决定其功能。因此，结合蛋白的鉴定对于理解lncRNA功能至关重要。然而，当前的方法表现出许多局限性，例如产生假阳性信号，并且不能在活细胞中完成。
CARPID的两个步骤：导航和生物素标记
为了克服现有方法的局限性，研究团队提出了一种新颖的方法，该方法可以联合利用现有的最新基因编辑技术CRISPR / dCasRx系统进行RNA靶向，并采用邻近生物素标记技术进行鉴定活细胞中蛋白质之间的相互作用。
该团队将新方法命名为CARPID，它是CRISPR辅助RNA-蛋白质相互作用检测的缩写。严博士说：“ CARPID可以灵敏地检测任何长度或浓度的RNA结合蛋白，而大多数其他方法只能应用于很长的非编码RNA。”
该方法由两部分组成：导航和邻近生物素标记。首先，该团队采用CRISPR / CasRx系统进行导航，以便CARPID组件(包括称为BASU的“标记工具”)可以接近目标RNA。BASU是一种工程化的生物素连接酶，是一种将生物素(一种具有强结合力的维生素)添加到与目标RNA结合的蛋白质上的酶。以此方式，将标记接近靶RNA的那些蛋白质。
标记后，研究小组随后使用一种称为链霉亲和素的生物素结合蛋白来鉴定那些被BASU标记的蛋白。这样，结合蛋白容易被揭示。
对不同长度的lncRNA具有高度的特异性和适用性
为了测试CARPID的特异性，研究小组将其应用于三种不同的lncRNA，即DANCR，XIST和MALAT1。实验结果表明结合蛋白没有太多的重叠。这证明了CARPID方法对不同长度和表达水平的lncRNA的高度特异性和适用性。
严博士解释说：“之所以能达到如此高的特异性，是因为CRISPR的导航非常精确。我们甚至可以准确地获得蛋白质结合发生在RNA哪一部分的信息。”
同样，CARPID不会影响目标细胞的生理状况，并且在整个过程之后，该细胞仍然活着并具有正常的基因表达格局。张博士补充说：“通过这种新方法，如果我们在不同时间检查相同的RNA靶标，我们可以获得动态结果。”
在张博士开发的蛋白质组学(蛋白质分析)技术的支持下，该团队能够发现和验证哺乳动物细胞中lncRNA的两个先前未表征的结合蛋白。
病毒RNA结合蛋白的检测
该团队认为CARPID具有广泛的应用，包括检测病毒RNA的结合蛋白。“例如，SARS-CoV-2是一种引起COVID-19的RNA病毒。一旦病毒感染细胞，我们就可以应用CARPID来检测该病毒在病毒生命周期中募集的细胞蛋白。如果我们消除了这种结合，蛋白质，我们很可能会抑制病毒的复制。这些信息可能有助于我们确定潜在的抗病毒药物靶标。”
此外，许多lncRNA被用作癌症的诊断生物标志物，因为它们在癌细胞中比正常细胞变得更加丰富。CARPID可用于检测癌细胞中这些lncRNA 的结合蛋白，这可能有助于寻找致癌机制和潜在的蛋白靶标，用于癌症的诊断或治疗。
团队花了大约一年的时间开发CARPID，并且大部分实验都是在CityU进行的。他们的下一步将尝试将其应用于干细胞和DANCR(一种通常用作肿瘤启动子的lncRNA)的研究。
